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2019年01月28日 浏览量: 次 评论(0) 来源:Current Biology Volume 28, Issue 23, 3 December 2018, Pages 3723-3735.e6 作者:李晓菲译 责任编辑:admin
摘要:前庭为平安彩票网提供姿势和运动相关信息,这些信息对于充分执行许多感觉运动任务是必不可少的。为了以生理的方式激活这种感觉系统,人们需要宏观地旋转或平移平安彩票网的头部,这反过来又使得同时进行的神经记录极具挑战性。
摘要:前庭为平安彩票网提供姿势和运动相关信息,这些信息对于充分执行许多感觉运动任务是必不可少的。为了以生理的方式激活这种感觉系统,人们需要宏观地旋转或平移平安彩票网的头部,这反过来又使得同时进行的神经记录极具挑战性。在此,我们报道了一种新型的小型化光片显微镜,该显微镜可以与头部受限的斑马鱼幼虫动态地共同旋转,从而实现可控的前庭刺激。显微镜的机械刚性使得人们可以以最先进的分辨率和信噪比进行全脑功能成像,在角位置加高到25°,旋转加速度为6000°/s2。我们通过产生第一张针对正弦和逐步前庭刺激的全脑反应图来说明这种新设置的潜力。反应性群体跨越多个大脑区域,并显示出双边对称性。使用Fourier和回归分析,我们识别出三个主要功能群,它们显示出对前庭刺激的明确阶段性和强直性响应模式。我们的可旋转光片显微镜为系统地研究脊椎平安彩票网大脑的前庭处理提供了一个独特的工具,并扩展了虚拟现实系统在模拟3D导航过程中探索复杂多感觉和运动整合的潜力。
 
关键词:斑马鱼  前庭系统  感觉加工 功能性全脑成像  钙成像  光片显微镜  显微发展  回归分析  4D数据可视化
 
简介:功能成像是电生理学在体内监测大脑活动的有力替代。当对小而透明的平安彩票网如斑马鱼幼体进行操作时,它允许对整个大脑进行长期、无创的记录,从而能够对神经元回路进行大规模分析。这种方法可以与各种感官刺激(如视觉、听觉、热或嗅觉)和行为监测相结合,以探索复杂感觉运动任务背后的神经计算。当斑马鱼在3D环境中运动时,它们的前庭装置不断地向大脑告知身体相对于重力的方向以及它的平移和旋转加速度。前庭信息与运动起始、姿势控制和注视稳定有关。前庭信号还能使斑马鱼幼鱼找到水面,以便使鱼鳔充气,或在压力下航行到地面。前庭缺陷平安彩票网无法生存。尽管前庭系统起着关键作用,但它仍然是一种感觉模式,其神经基底不能用脑功能成像探测。这归功于这种感觉系统所构成的特殊挑战,其生理激活需要动态地旋转。如果在非运动显微镜下进行,这种运动将不断改变成像的大脑切片,排除了随着时间的推移监测单个神经元活动的可能性。Favre-Bulle等人结果表明,用光镊直接移动内耳器官中的小结构,即传递前庭信息的耳石,可以诱发固定头部的幼虫的前庭行为反应。这种虚拟的刺激方法在可实现的刺激模式方面提供了很大的灵活性,并且与本文一起报告的一项研究显示,这种方法与功能成像兼容。然而,由于光学镊子施加在耳石上的力没有校准,因此该方法不允许以可控和可再现的方式传递天然的前庭刺激。如最近提出的,在自由游动的鱼中通过功能记录也可提供补充途径。然而,它缺乏从运动变量中分离前庭的可能性,并且局限于二维轨迹。在此,我们报告一种旋转光片显微镜的开发和应用,该显微镜使头系平安彩票网共同旋转,从而刺激前庭系统,同时提供稳定的成像条件。这种紧凑的旋转显微镜提供了在幼年斑马鱼生理动态前庭刺激期间单细胞分辨的全脑记录。我们首先详细介绍了旋转显微镜的设计以及它在机械稳定性和成像性能方面的表征。接下来,我们通过同时监测接受正弦和逐步滚动运动的斑马鱼幼虫的大脑尺度神经元活动和补偿性眼球运动来证明该系统的全部潜力。在第二部分中,我们着重于使用瘫痪或双核鱼进行神经元反应,以便最小化或抑制与补偿性眼球运动相关的视觉输入。我们定量地描述全脑前庭反应。该反应图发现包括跨越多个脑区的延伸神经元集合,并表现出高度刻板印象的双侧对称性。
 
小型旋转式数字扫描光板显微镜:结合功能成像提供生理性前庭刺激需要动态地使整个成像系统和平安彩票网共同旋转,这反过来又对其机械刚性提出严格要求。在显微镜旋转过程中,由于重力变化而引起的任何机械变形都可能确实使成像平面位移。这种位移会暂时使另一组神经元聚焦,导致荧光记录中的有害伪影。为了缓解这些问题,我们设计了一个用于三维、数字化扫描光片显微镜。通过将光学部件的数量减少到最小,与标准数字扫描的光学薄片显微镜相比,光路尺寸减小了10倍。这种紧凑的设计消除了大多数机械变形,并使显微镜对振动基本上不敏感。在这个设计中,我们省略了一个中继系统,该中继系统通常用于通过将反射镜的枢轴点带到照明物镜的后焦平面来确保平行光束偏转。然而,我们计算得到的激光指向在近似平方毫米视场中的变化小于α=0.4°。因为它发生在光片平面内,所以这种偏差对成像性能没有影响。光束在光纤出口处的发散提供了足够的数值孔径,用于获得微米厚的光片,而无需引入扩束系统。当激光沿相反方向通过两个相同的目标时,这种结构补偿了球面像差。
 
显微镜旋转过程中成像保持稳定:我们利用微球的三维跟踪来刻画旋转时我们装置的稳定性。简言之,直径为1μm的荧光微球嵌入琼脂因此,通过监测环随时间变化的中心位置和半径,样本运动可以用3D来表征。糖中的图像显示出同心环形式的特征干涉图案。它们的直径是微球相对于焦平面位置的函数。在z方向上的跟踪精度是10nm(SD,N=5),由校准测量得出。我们发现,正弦显微镜旋转±20°时,扫描体积沿z方向移动小于500nm,即只有典型体细胞直径(8μm)的6%,在x-y平面上移动小于2μm。为了量化与这些运动相关的噪声水平,我们对瘫痪鱼进行神经表达红色荧光蛋白(HuC:RFP)的对照实验,该蛋白不报告神经元活性。我们测量了由不同振幅的逐步微镜旋转引起的每个像素的强度变化分布,并将其与在零度静态微镜时的本征噪声分布进行了比较。这两种分布的SD差异被用来测量机械诱导荧光噪声。我们发现,随旋转振幅的增加而增加,但在±25°的范围内,F/F(平均在3条鱼上)保持在2%以下。然后,我们对泛神经表达钙报告基因GCaMP6s的瘫痪鱼重复同样的分析。在这些实验中,保持在3%F/F以下,并且与RFP鱼测量的旋转角度具有相同的相关性。因此,即使在显微镜旋转期间,在信噪比和空间分辨率方面,小型化装置的成像质量仍然等同于最先进的光片装置。
 
动态前庭刺激中的全脑成像与行为监测:为了展示我们平台的全部潜力,我们同时监测全脑神经元的活动和在正弦和逐步旋转期间诱发的行为反应。在这些实验中,将表达GCaMP6s的幼虫全神经部分包埋在琼脂糖中,以允许眼睛自由运动。鱼通过重力惯性前庭眼反射(黄斑眼反射)对滚动刺激作出反应,并伴有补偿性眼球运动,以保持清晰的视觉。两种刺激方案都引起幼虫大脑神经元活动的延长激活。神经元的活动似乎与刺激有关,局限于特定的大脑区域,并且相对于中矢状面不对称。随着时间推移,单个神经元的活性随着正弦波的刺激而变化,并且相对于显微镜旋转有各种明确的相移。在逐步刺激期间,我们观察到,除其他外,调谐到鱼向左或向右角度位置的类紧张性反应。这些实验证明,所开发的平台提供了必要的稳定性和成像分辨率,以监测大脑规模的神经元活动以及自然前庭刺激诱发的行为反应。在两组实验中,我们注意到顶盖和顶盖神经毡中的刺激相关活动,这两个区域是已知的主要的视网膜受体区域。我们怀疑这种活动可能部分或全部由眼睛旋转引起的视觉感觉系统的同时刺激引起。尽管实验是在黑暗中进行的,但蓝色激光不可避免地会产生样品室的漫射照明,从而为平安彩票网提供视觉线索。由于该腔室相对于平安彩票网体(附头物体)是静态的,因此期望该残余视觉图案稳定眼睛位置,从而与前庭驱动的补偿性眼睛旋转相冲突。这种视觉驱动的反作用力可能很小,因为行为反应的增益(眼睛和身体转动的比率)被测量为0.61±0.2(SD,N=9),即甚至大于在完全黑暗中执行的行为测定中报告的值。因此,如果存在视觉输入,则与前庭输入相比,它们对眼睛动力学的影响肯定是温和的。然而,这并不排除视觉刺激可能解释在视觉反应区域中观察到的一些反应的可能性。为了最大限度地减少任何非前庭输入,以下所报告的所有实验都是用瘫痪和完全嵌入的鱼进行的,因此,排除(1)与眼球运动引起的视网膜滑移相关的视觉输入,(2)由肌肉收缩引起的本体感觉输入,(3)来自侧线的流体机械输入。
 
动态前庭刺激的神经元反应是左右对称和高度刻板:将正弦波滚动刺激传递给完全嵌入琼脂糖中的瘫痪鱼。我们观察到强烈的全脑神经元活动。我们通过Fourier分析计算每个脑体素的振幅(以信噪比为单位)和信号相对于刺激的相移(STAR方法),来量化这种全脑前庭反应。我们在响应中发现了相移的连续性,但是最大的响应幅度主要针对7/8π或15/8π的相移。这些相移是从荧光信号直接计算的,因此需要用φGCaMP=-1.35rad来抵消,以解释钙报告延迟响应,以便捕获实际的尖峰率动态。考虑到这一校正,这两个主要群体似乎对旋转角和速度的中间值显示出最大响应。因此,这些神经元可以被描述为混合角度和速度调谐。为了更精确地描述这种功能组织,我们将相图分成四个非重叠相移区间。第一阶段间隔(i)对应于速度调节神经元,它们主要位于小脑和耳朵周围。第二阶段间隔(ii)包括混合角度和速度调谐神经元,它们以相反的符号响应角度位置和速度。它们位于小脑和外侧菱形体6以及菱形体2-5的内侧部分。第三阶段间隔(iii)的神经元被调谐到角位置。它们分布在整个大脑,特别是在缰核、视顶盖、外侧被盖、小脑和后脑最内侧的部分。最大响应神经元群发现于第四阶段间隔(iv),其对应于混合角度和速度调节神经元,同时对相同符号的角位置和速度作出响应。这个群集包括纵向环面、缰核、视顶盖、被盖内的神经元,包括nMLF、动眼核、滑车核-小脑、前庭核、前庭脊髓神经元、下橄榄和菱形体7中的神经元,但在菱形体3-6的中后脑中没有神经元。为了研究这种相位图在不同鱼类之间是如何保守的,我们从八种平安彩票网中计算出了平均相位图。在缰核、纵环和顶盖平均后,相位图的强度大大降低,这表明在这些区域中,关于相位响应的功能组织不是刻板的。相比之下,被盖、小脑和后脑都显示出强烈的平均反应,反映了更刻板的功能组织。
 
回归分析揭示前庭阶跃刺激的三组不同时相和强调反应模式:对瘫痪和完全嵌入的鱼类进行类似的逐步刺激方案。该方案由三个步骤组成,该方案由三个步骤组成,在零度旋转角度时,增加幅度(10°、15°和20°)的正负交替显微镜旋转,间隔20-s停留时间。反应神经元可分为两组,其活动与顺时针(正)或逆时针(负)旋转相关。与阶跃刺激的绝对相关系数最大的神经元对正弦刺激的反应幅度也最大。正弦显微镜旋转7/8π后,神经元产生正向反应。
 
结论:这种旋转显微镜允许施加幅度高达25°的身体旋转,并在不到10ms内达到高达60°/s的速度。它已经足以模拟鱼在3D主动勘探或与水流有关的缓慢摇摆运动期间所经历的重力方向的变化。这项技术发展将通过结合前庭感觉来扩展虚拟现实系统的潜力,以便研究3D导航过程中复杂的多感官-运动整合。
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