实验攻略

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2019年01月08日 浏览量: 次 评论(0) 来源:南京尧顺禹 作者:南京尧顺禹 责任编辑:admin
摘要:南京尧顺禹围绕模式平安彩票网斑马鱼、以基因组靶向改造技术为核心,持续不断地为相关的医院、高等院校和科研院所等提供人类疾病斑马鱼模型建立、功能基因组学研究、和药物筛选等技术服务和相关产品。

1、Q:利用crsipr敲除,可以用瞬转质粒嘛?

A:可以!这样做得到的细胞是mosaic,即有的细胞是基因组编辑了,有的则没有;有的细胞基因敲除了,有点则没有。如果只要改变部分细胞基因即可的话,则可以通过瞬转,如以原代细胞为研究对象。

 

2、Q:保存领到的质粒和菌液,说明书上说质粒保存温度-20/-80℃,怎么决定?我把领到的装质粒和菌液的离心管插到一个管插上直接放进-80℃冰箱可以吗?

A:在两个温度下都可以保存,但请注意,质粒可保存的时间较短(12年)。建议将相应的细菌加甘油,可在-80℃下长久保存。细菌需要加冷冻保护剂甘油才能冻存到-80℃冰箱中,质粒直接放入。

 

3、Q:我想把CRISPR-Cas9质粒的flag标签直接替换成GFP标签,是不是可以直接对FLAG标签附近的酶切位点进行双酶切就可以了?谢谢!

A:FLAG附近没有可以直接用于酶切的酶切位点。

 

4、Q:请问可以用cas9技术对腺病毒骨架质粒进行编辑吗?

A:可以。

Q:在真核细胞还是原核细胞里好改造?

A:多大的质粒?一般改造质粒在体外用常规的分子操作即可。

Q:转过质粒后用puro筛选细胞,细胞传了几代不怎么死了,请问是剩下的这些细胞都是转进了质粒呢还是传代对细胞有影响,还是相当于只用药筛了一个生长周期?

A:有可能是抗生素浓度过大造成的,如果质粒表达荧光蛋白可以镜检一下,不过传代次数多了荧光也会减弱。

 

5、Q:我这边用咱们的质粒做了个敲除实验,结果很不错,现在我对敲入很感兴趣,想问一下定点敲入的话,供体质粒怎么选择?

A:供体的设计取决于期望敲入DNA片段的情况。

 

6、Q:cas9质粒转染细胞后需要做CruiserTM酶筛选阳性克隆吗?是不是也需要确定一下基因敲除的效率约为多少呢?

A:我们建议的策略是直接测序,不建议酶切,因为直接测序结果更明确,性价比更高(可避免假阳性结果),对于酶切,我们没有成功经验。

 

7、Q:我想验证质粒是否已整合到基因组上,想设计一对puro的引物,然后去基因组上扩增,首先想拿质粒上的这段puro基因去NCBI中先比对一下,我是应该和pac基因的序列比对吗?

A:你所说的pac基因是什么意思?GenBank上应该可以找到puro的编码序列。上ncbi网页,将pcr产物的测序结果直接比对(BLAST)就可以。

Q:我拿质粒上的puro序列和puro的全序列进行了比对,发现在1650bp处的碱基发生了替换,这对puro的抗性会有影响吗

A:看看是否为同义突变?一般不会有问题。

 

8、Q:我想用Crispr构建一个基因敲除的慢病毒载体,在细胞里做loss of function,公司说评估了一下我们的基因,回复sgRNA评分很低,没办法三保一,我想问一下,在sgRNA评分低的情况下,这个基因还能不能做?

A:已有的软件给出的sgRNA活性评价都是基于有限的实验数据,对未知的sgRNA活性推测只能具有参考意义。鉴于慢病毒包装比较贵,而制备All-in-OnesgRNA表达质粒要便宜很多,因此建议首先在细胞系上(同物种,转染效率高)先进行sgRNA活性检测,以筛选到有活性的sgRNA。一旦筛选到有活性的sgRNA,未来只要包装一个有活性的sgRNA表达载体/Cas9表达载体的慢病毒即可。

 

9、Q:我想请教一个问题,我们用cas9工具慢病毒敲除一个A基因后,想再把带有一个突变位点的A基因(带有突变A基因的载体是质粒)插入基因组内,可以请教一下转染了慢病毒之后多久之后转染质粒,这个突变基因插入基因组内的成功率会比较高呢?

A:工作对象是原代细胞还是细胞系?

Q:细胞系。

A:那么质粒转染没有问题了。不过,有一个问题,含突变位点的A基因是否会被病毒携带的基因组编辑工具所识别,如果是,成功重组的表达质粒中的A基因会被基因组编辑工具所编辑,就有可能实现不了你的目标。敲除可以考虑直接用质粒瞬转,敲入使用慢病毒,这样更合理。

 

10、Q:是否能将sgRNA单链序列(20+60)和Cas9蛋白共同注射到靶细胞,然后检测编辑效果?

A:细胞系一般用质粒转染方式递送DNA形式基因组编辑工具、原代细胞用病毒转导递送DNA形式基因组编辑工具、受精卵用显微注射方式递送RNP形式基因组编辑工具。

 

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